GİRİŞ
Karbon, yer kabuğunda en çok bulunan elementlerden biridir. Karbon bazlı malzemeler, yüksek kimyasal direnç kabiliyeti, verimli mekanik özellikleri, düşük ağırlıklı karakterleri ve vücutta yüksek oranda dağılma yeteneğine sahip olmaları nedeniyle birçok faklı uygulama alanına sahiptir. Karbon atomlarının birbirlerine farklı şekillerde bağlanmasıyla özellikleri birbirinden farklı malzemeler oluşmaktadır. Birkaç katmanlı grafenler, grafen oksit (GO), karbon nanotüpler, nano elmaslar ve indirgenmiş GO’lar biyomedikal sistemlerde kullanılan karbon türevleridir (1).
Grafen ilk olarak Nobel ödüllü Andre Geim ve Konstantin Novoselov tarafından kristal grafitik filmler olarak tanımlanmıştır. İki boyutlu bir yapıya sahip olan grafen, 1 atom kalınlığında ve sp2 hibrit karbon atomlarının bağlanmasıyla oluşan bal peteği görünümündedir. Grafenler, özgül yüzey alanı (2630 m2G-1), yüksek yük mobilitesi (200.000 cm2 V-1·S-1), yüksek Young modülü (~1.0 TPa), yüksek termal iletkenlik (~5000 Wm-1·K-1) ve yüksek optik geçirgenlik (~%97,7) gibi benzersiz termal, elektriksel ve mekaniksel özelliklere sahiptir (2-4). Bu özellikler nedeniyle grafen bazlı malzemelerin, doku mühendisliği, biyo-algılama, gen iletimi ve kanser tedavisi de dahil olmak üzere çeşitli biyomedikal uygulamalarda kullanımı gün geçtikçe artmaktadır (1,5).
GO, grafenin kimyasal olarak modifiye edilmiş bir formudur ve grafen hidrofobikken, GO hidrofiliktir. Bu özelliği GO’nun biyolojik sistemlerde ilaç dağıtım ajanı, hücresel görüntüleme probları ve biyosensör olarak kullanılmasını elverişli kılmıştır (1,6,7). Hem aromatik (sp2) hem de alifatik (sp3) alanları içermesi nedeniyle GO'nun yüzeyi elektrostatik etkileşime izin verecek şekilde daha da geniştir ve ilaç bağlanmasına olanak sağlar. Dolayısıyla ilaç salınımı çalışmalarına da uygunluk göstermektedir (5,8). GO’nun toksik veya biyouyumlu bir malzeme olarak işlevselliği, bileşimine, boyutuna, yüzeyine, şekline, fonksiyonel gruplarına, yüküne, kaplamasına ve çözünen ortama bağlıdır. Litaratürde GO’nun sentezlenmesinde birden çok yöntem kullanılmaktadır (9,10).
Bu çalışmada GO’nun sentezlenmesi ve sentezlenen GO’nun sitotoksik etkisinin embriyonik böbrek hücrelerinde değerlendirilmesi amaçlanmıştır.
YÖNTEMLER
Grafen Oksit Sentezi
GO sentezi modifiye Hummers yöntemi ile gerçekleştirilmiştir (11). GO sentezinde kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta kullanılmıştır: Sülfürik asit (H2SO4) (MERCK, 7664-93-9, Almanya), fosforik asit (H3PO4) (MERCK, 7664-38-2, Almanya), grafit, potasyum permanganat (KMnO4) (ISOLAB, 7722-64-7, Almanya), hidrojen peroksit (H2O2) (%30 ağırlık) (MERCK, 1085972500), hidroklorik asit (HCl) (%38 ağırlık) (ISOLAB, 7647-01-0), Almanya), susuz etanol (ISOLAB, 64-17-5, Almanya), sodyum hidroksit (NaOH) (MERCK, 106498.1000, Almanya).
GO sentezi için 360 mL H2SO4 ve 40 mL H3PO4 behere konularak sabit sıcaklıkta 200 rpm’de karıştırılmıştır. Ardından 3 g grafit ve 18 g KMnO4 yavaşça solüsyona eklenmiştir. Bu reaksiyon 40-45 °C sıcaklıkta 16 saat boyunca karıştırılmıştır. GO sentezlenmesi için 16 saat boyunca karıştırılan süspansiyon, içinde 400 g buz olan behere aktarılmış ve karıştırılmaya devam edilmiştir. Süspansiyon buzla birlikte karışırken, içine 3 mL H2O2 (%30 ağırlıkça) damla damla eklenmiştir. Elde edilen karışım 3000 rpm’de 45 dakika boyunca santrifüjlenmiştir. Santrifüj sonrası süpernatant (asit) atık kutusuna boşaltılmıştır. Pelletlerin yıkanması ve ardından etüvde kurutulmasıyla GO elde edilmiştir.
Grafen Oksitin Karakterizasyonu
Elde edilen GO yapısında bulunan fonksiyonel grupların tespiti için Fourier Transform Infrared (FT-IR) spektroskopi (Nicholet FT-IR Spektrometresi) kullanılarak 4000-400 cm-1 aralığında FT-IR analiz yapılmıştır. Geçirmeli elektron mikroskobu (Jeol JEM 2100 plus) ile numunelerin görüntüleri alınmıştır.
Hücre Kültürü
Ticari olarak temin edilen insan embriyonik böbrek hücreleri HEK293T (CRL-1573) (The American Type Culture Collection-ATCC; Manassas, VA, USA) %89 Dulbecco’s modified eagle medium, %9 ısı ile inaktive edilmiş fetal bovine serum ve %1 antibiyotik solüsyonu (100 U/mL penisilin ve 100 U/mL streptomisin) ile hazırlanan besiyerinde 37 °C, %5 CO2 inkübatöründe kültüre edilmiştir. Hücreler %70-80 yoğunluğa ulaşınca önce Dulbecco’s fosfat buffer saline ile yıkanmış, sonrasında %0,25 tripsin-EDTA ile flask zemininden kaldırılmıştır. Tripsin-EDTA-hücre süspansiyonu 120xg’de 5 dk santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonrası süpernatant atılarak hücre peleti üzerine taze besiyeri eklenmiştir. Hücreler 96 kuyucuklu plakalara (1x104 hücre/kuyucuk) ekilerek inkübe edilmiştir. Tüm kimyasallar ticari olarak temin edilmiştir (Euroclone S.p.A.; Via Figino-Italy).
Grafen Oksit Uygulanması ve 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolyum bromür (MTT) Testi
Hücre canlılığı, proliferasyon ve sitotoksisite değerlendirilmesinde hücresel metabolik aktiviteyi ölçmek için MTT testi kullanılmıştır. Bu kolorimetrik test, sarı tetrazolyum tuzu olan MTT’yi mor formazan kristallerine dönüştürmek için metabolik olarak aktif hücreleri kullanır. Canlı hücrelerdeki NAD(P)H bağımlı oksidoredüktaz enzimleri MTT’yi formazana dönüştürür. Çözünmeyen formazan kristallerini çözmek için dimetil sülfoksit (DMSO) kullanılarak, oluşan renkli çözeltinin absorbansı spektrofotometrede ölçülür. Daha koyu olan kuyucuklarda metabolik olarak daha aktif canlı hücreler vardır, hücre canlılığının azaldığı kuyucuklarda renk daha açıktır (12,13).
Çalışmamızda GO’nun etkin dozunun (IC50) belirlenmesi amacı ile hücreler 96 kuyucuklu plakalara 1x104 hücre/kuyucuk olacak şekilde ekilmiştir. Hücre ekiminden 24 saat sonra kontrol grubu taze besiyeri ile deney grupları farklı konsantrasyonda GO (1000-500-250-125-62,5-31,25-15,62-7,81-3,90 µg/mL) ile 24, 48 ve 72 saat inkübe edilmiştir. Deney süresi sonunda tüm kuyucuklardan besiyeri uzaklaştırılmıştır. Kuyucuklara 100 μL taze besiyeri ile 10 μL (5 mg/mL) MTT solüsyonu eklenmiş ve hücreler 3 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresi sonunda her kuyucuğa 100 μL DMSO ilave edilmiş ve absorbans değerleri 570 nm’de ELISA mikroplaka okuyucuda (Multiskan GO-Thermo) ölçülmüştür. Optik dansite değerleri kullanılarak GraphPad Prism 9 programı ile GO için hücre canlılığının %50 azalmasını sağlayan doz (IC50) değerleri belirlenmiştir.
Ölçümler 3 tekrarlı yapılmıştır ve sonuçlar ortalama değer olarak ifade edilmiştir, istatistiksel değerlendirme yapılmamıştır.
BULGULAR
Fourier Transform Infrared Spekroskopisi Analizi
FTIR Spektrumları Şekil 1’de verilmiştir. 3000-3500 cm-1 arasında, GO üzerine adsorbe olan su moleküllerinin OH gruplarının gerilme ve bükülme titreşimine karşılık gelen geniş bir pik görülmektedir. Bu pik GO’nun güçlü bir hidrofilik yapıda olduğunu gösterir. 1735 cm-1’deki karakteristik pikler karboksil C=O grubunu, 1630 cm-1’deki pik, aromatik C=C grubunu göstermektedir. CH2’nin gerilme titreşimlerine 2920 cm-1 ve 2850 cm-1’deki absorpsiyon pikleri karşılık gelmektedir. 1200 cm-1’deki absorpsiyon pikleri, karboksilik asidin C-O bağının gerilme titreşimini göstermektedir. 2925 cm-1, 2119 cm-1, 1768 cm-1, 1631 cm-1, 1380 cm-1, 916 cm-1 ve 534 cm-1 aralığında absorpsiyon bağlarının varlığını göstermektedir.
Morfolojik Karakterizasyon
Şekil 2’ye bakıldığında GO’nun, karakteristik tek katmanlı özelliği nedeniyle kısmen tekdüze şeffaf bir morfolojiye sahip olduğu görülmektedir. Oksidasyon işlemi sırasında oksijenli fonksiyonel grupların oluşturduğu büyük spesifik yüzey alanı sebebiyle yüzeyde çok sayıda bükülme ve düzensiz kırışıklıklar gözlemlenmektedir (14).
MTT Sonuçları
HEK293 hücreleri farklı konsantrasyonlarda GO (1000-500-250-125-62,5-31,25-15,62-7,81-3,90 µg/mL) ile muamele edilmiştir. Süre ve doza bağlı olarak GO’nun hücre canlılığını azalttığı gözlemlenmiştir (Şekil 3). IC50 değerleri µg/mL olarak hesaplanarak ve Tablo 1’de verilmiştir.
TARTIŞMA
Karbonun, doğada en yaygın bulunan elementlerden biri olmasından dolayı, karbon esaslı malzemelerin diğer inorganik malzemelere kıyasla biyouyumluluğunun daha yüksek olduğu bilinmektedir. Özellikle grafit, kritik toksisite sorunları olmadan yüzlerce yıldır günlük hayatımızda kullanılmaktadır. Tek bir grafit tabakası olan grafenin benzersiz fiziksel ve kimyasal özelliklerinden dolayı biyolojik çalışmalarda kullanımı gün geçtikçe artmaktadır (1,2,3,7).
Bu çalışmada sentezlediğimiz GO’nun insan embriyonik böbrek hücrelerinin canlılığı üzerine sitotoksik etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla GO’nun 1000-500-250-125-62,5-31,25-15,62-7,81-3,90 µg/mL konsantrasyonlarının HEK293 hücreleri üzerindeki etkisini mitokondriyel aktiviteye bağlı olarak değerlendirilen MTT analizi ile yapılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre 24 ve 48 saat inkübasyon süresinde ve 125-62,5-31,25-15,62 µg/mL konsantrasyonlarında hücre canlılığı %75’in üzerinde bulunmuştur. GO inkübasyonu 72 saat olduğunda ise 62,5 µg/mL konsantrasyonunun üzerindeki değerlerde hücre canlılığı %65’in altına düşmüştür. Yirmi dört, 48 ve 72 saat inkübasyonları için %50 canlılık konsantrasyonlarını gösteren IC50 değerleri sırasıyla 206,18 µg/mL, 108,98 µg/mL, 55,54 µg/mL olarak hesaplanmıştır. GO ile inkübasyon süresi arttığında mitokondriyel hasarın artırdığı, dolayıasıyla hücre canlılığı üzerine olumsuz etki gösterdiği belirlenmiştir.
Günümüzde farklı grafen türevlerinin biyolojik etkilerinin araştırıldığı in vitro ve in vivo birçok çalışma yapılmaktadır (4,6,9). Zhang ve ark. (15) PC12 hücrelerinde yaptıkları çalışmada farklı yapıya sahip grafen türevlerinin sitotoksik etkisinin grafen yapısı ile direkt ilişkili olduğunu tespit etmişlerdir. Grafenin etkilerinin araştırıldığı farklı bir çalışmada da Wu ve ark. (16) nano çinko oksitin A549 hücrelerinde oluşturduğu hücre canlılığı, oksidatif stres, mitokondrial depolerizasyon ve membran hasarı üzerindeki toksik etkilerinin grafenle bağlandığında göstermediği tespit edilmiştir.
Grafen türevlerinden biri olan GO, hidrofilik yapısından dolayı biyolojik sistemlerde kullanımı için ilgi çekici olmaktadır. GO’nun geniş uygulama alanı nedeniyle, GO tabanlı teknolojilerin güvenli ve sürdürülebilir gelişimi için GO’nun sitotoksisitesinin kapsamlı bir şekilde anlaşılması gerekmektedir (6). Biz de bu çalışmamızda modifiye Hummers yöntemi ile sentezlediğimiz GO’nun HEK293 hücrelerinde oluşturduğu etkiyi gözlemlemeyi amaçladık.
Wang ve ark. (17) modifiye Hummers yöntemi ile sentezledikleri GO’nun biyouyumluluğunu insan fibroblast hücrelerinde ve fareler üzerinde değerlendirmişlerdir. GO’nun 20 μg/mL’den daha düşük dozda uygulanması insan fibroblast hücrelerinde toksisite göstermezken, 50 μg/mL’nin üzerindeki dozlarda hücre adezyonunda azalma, apoptozu indükleme, lizozomlara, mitokondriye ve hücre çekirdeğine girme gibi belirgin sitotoksik etkiler gösterdiğini belirtmişlerdir. Fareler üzerinde ise düşük ve orta doz uygulanan GO’nun belirgin toksisite göstermediği, fakat yüksek dozlarda (0,4 mg) karaciğer, dalak ve böbrekte birikim ile birlikte akciğer granülomu gibi kronik toksisite sergilediği tespit edilmiştir. İnsan eritrositleri üzerinde yapılan bir çalışmada GO’nun doza bağlı hemolitik aktivite gösterdiği, ayrıca GO numunelerinin parçacık boyutunun da hemolik aktivitede kritik rol oynadığı bildirilmiştir (18). Kardiyomiyoblast hücre hattı üzerine nanoGO’nun etkilerinin araştırıldığı bir çalışmada 20, 40, 60, 80 ve 100 μg/mL nano-GO ile 24 saat inkübasyonun mitokondriyal hiperpolarizasyona, sebest radikal üretimine ve 40, 60, 80, 100 μg/mL konsantrasyonlarda DNA hasarına sebep olduğu gözlemlenmiştir (19). Lammel ve ark. (20), GO’nun oluşturduğu sitotoksik etkinin plazma zarı hasarı yoluyla doza bağımlı olarak gerçekleştirdiğini, GO’nun fosfolipid çift tabakası ile güçlü bir fiziksel etkileşim kurarak plazma zarının yapısal bütünlüğüne zarar verdiğini göstermişlerdir. Ayrıca, GO’nun plazma zarına nüfuz edebildiğini, bunun da değişmiş hücre morfolojisi ve artan sayıda apoptotik hücre ile sonuçlanabileceğini bildirmişlerdir (20).
Ünal ve ark. (4) farklı grafen türevlerinin kanser hücrelerine etkisini araştırdıkları çalışmalarında; A549 insan akciğer epitelyal karsinoma hücrelerinde GO’nun 1000 µg/mL’lik en yüksek dozunun dahi %17 oranında ölüme yol açtığını, MCF-7 meme kanseri hücrelerinde en fazla etkiyi gösteren test edilen en düşük doz olan 1,96 µg/mL’lik dozun %11 oranında ölüme yol açtığını tespit etmişlerdir. Fakat aynı grafen türevlerinin sağlıklı 293-T insan embriyonik böbrek epitel hücrelerinde anlamlı sitotoksik bir etki göstermediği rapor etmişlerdir (4). Fakat Hu ve ark. (21), GO’nun etkisinin, %10 fetal bovin serumu ile inkübasyon yoluyla büyük ölçüde zayıflatıldığını, bunun nedeninin ise GO’nun son derece yüksek protein adsorpsiyon kabiliyetine sahip olması olarak belirtmişlerdir (21). İn vitro yapılan bir başka çalışmada da düşük doz GO’nun A549 hücre hattının morfolojisine, canlılığına ve membran bütünlüğüne etkisinin olmadığı, ancak doza bağımlı bir oksidatif strese neden olabileceğini ve yüksek dozlarda hücre canlılığında azalmaya neden olduğunu bildirmişlerdir (22). Yapılan çalışmalara benzer olarak bizim çalışmamızda da HEK293 hücrelerine uygulanan farklı konsantrasyonlarda GO’nun hücre canlılığını süre ve doza bağlı olarak azalttığı gözlemlenmiştir.
Çalışmanın Kısıtlılıkları
GO’nun sitotoksik etkisinin belirlenmesinde ve hücre ile etkileşiminin aydınlatılmasında moleküler düzeyde çalışmaların yapılması gerekmektedir. Bu anlamda, çalışmamız GO’nun etkisinin araştırılması için bir ön çalışma olarak kabul edilebilir.
SONUÇ
Farklı metotlarla sentezlenen grafen türevlerinin biyomedikal uygulamalarda kullanılabilirliğini artırmak ve uzun vadeli toksisite/biyouyumluluk verilerini değerlendirmek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.
Etik Komite Onayı: Bu çalışma etik kurul onayı gerektirmemektedir.
Hasta Onamı: Bu çalışma hasta onamı gerektirmemektedir.
Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu tarafından değerlendirilmiştir.
Yazar Katkıları: Konsept - N.P.Ö., D.D.E.; Dizayn - N.P.Ö., D.D.E.; Veri Toplama veya İşleme - N.P.Ö., D.D.E.; Analiz veya Yorumlama - N.P.Ö., D.D.E.; Literatür Arama - N.P.Ö., D.D.E.; Yazan - N.P.Ö.
Çıkar Çatışması: Yazarlar tarafından çıkar çatışması bildirilmemiştir.
Finansal Destek: Yazarlar tarafından finansal destek almadıkları bildirilmiştir.